摘（zhāi）要：每（měi）天2次注射FSH，進行牛的（de）超排必須（xū）處理得當，否則由於基層技術人員的誤操（cāo）作將提高超排失敗的可能（néng）性。我（wǒ）們設（shè）計了3個試驗，應用透明質酸為基（jī）礎的緩釋物（SRF）稀釋促（cù）卵（luǎn）泡素（sù）V，然後單次（cì）肌肉內（IM）注射肉牛，進行超排效果的評估。試（shì）驗1，將奶牛分成3組，進行每天（tiān）2次（cì）的注射程序與（yǔ）2種（zhǒng）注射方法的對比研究（jiū）；為期4天，每天2次（對照組）的IM的牛（n=6）的超排（pái）反應，大於單次皮下（注射SC）SRF（n=6），而奶（nǎi）牛（n=6）單次IM的SRF的反應位於兩者之間。試（shì）驗2，比較單次IM注射程（chéng）序中，兩種SRF的濃度（20mg/ml的透明質酸，100% 對比10mg/ml的透（tòu）明（míng）質酸，50%）影響。結果黃體（CL）的平均數沒有（yǒu）顯著差異（P≥0.05），但總的（de）卵子/胚胎數（P＜0.05）、受精卵（P＜0.01）和可移植胚（pēi）胎數（shù）（P＜0.001），100% SRF處（chù）理組（n=20）是優於50% SRF處理組（n=20）。試驗3，在紅色（sè）安格斯奶牛上對比（bǐ）單次IM 100% SRF 稀（xī）釋的FSH效果，與傳統的為期4天，每（měi）天2次的超排效果。CL的平均數（13.7±1.2 VS 13.8±1.2），總胚胎數（shù）（12.3±1.5 VS 13.7±1.2），受精卵（luǎn）（7.2±1.1 VS 8.4±1.4）和可移植胚胎（4.9±0.8 VS 6.4±1.3），在對（duì）照組（n=29）和單次注射組（n=29）中沒有顯著差異。
1. 前言
肉牛超排（pái）處理的主要（yào）目（mù）的是誘發更多的排卵，致使產生更多的可移植胚胎和移植後的更高妊娠率。然而，供（gòng）體對於促性腺激素的處理有很大的變（biàn）異性，其對胚胎移植也有主要的影響。最近（jìn）對發情周期和卵泡波的研究進（jìn）展表明（míng），在卵泡波啟動的時候用激素處理將獲得（dé）較好（hǎo）的超排效果，卵泡波的同期啟動方法現在已有較優的設計。
供體（tǐ）牛的超排處（chù）理可以通過傳統的單次IM 孕馬（mǎ）血清促性腺激素（eCG），或者每日2次IM垂體提取物FSH來實現，孕馬血清促性腺激素是一種複雜（zá）的糖蛋白激素，其半衰（shuāi）期為（wéi）40小時，單次注射可引起超排；而（ér）FSH在奶牛（niú）體內的生物半（bàn）衰期不足5小（xiǎo）時，必須多次處理才能誘發超排。用垂體提取物每日2次的IM處理的超排反應優於每日1次的處理。因此，垂體衍生物激素的處（chù）理必須謹（jǐn）慎，否則由於錯誤處理貨注射將提（tí）高失敗的可能性，另外，每日（rì）兩次的處理將引起供體牛（niú）的（de）過度應激，這將使得以後的超排反應逐漸減弱。故簡單的卵泡超排程序將有望減少供體牛的超排處（chù）理費用，提高其反應（yīng）能力，尤其對不易處理的動物而言。
用垂體粗提物（FSH-P），以明膠鹽為媒介稀釋後一次性快速注射後的效果類似於每日兩次，共5天的超排程序，然而，這單次（cì）注射的產（chǎn）生的可移植胚胎數非常少。其他人也用FSH氫氧化鋁凝膠或聚維（wéi）酮製劑的，但其（qí）結果不穩定。然而，也（yě）有一個擔憂（yōu）就是（shì）垂體提取物和這（zhè）些集合物的超排，可能使得牛體內產生對FSH 的抗體物。
單次注射FSH程（chéng）序將（jiāng）是傳統的每日2次處理（lǐ）程序的牛超排處理的選擇途徑之一，單次處理程序（xù）可能更加適用於缺少技（jì）術人（rén）員的牛場。在一項使（shǐ）用垂體純提取物，促（cù）卵泡（pào）素V超排研究中，單次皮（pí）下注射400mg NIH-FSH-P1肉（ròu）用奶牛的媒介物（wù），體況較高（gāo）（＞3/5）的牛的超排反應（yīng）與傳統的每日（rì）2次、共4天的處理結果相似，然而，此結果在有較少皮下脂肪組織的荷斯坦奶牛上未能（néng）重複。在另一項荷斯坦奶牛的研究中，單次注射的FSH-V被分成2份，在處理的第一天皮下注射75%，48小時後注射剩餘的25%，而前列腺素是正常注射，超排反應（yīng）與傳統的4天處理程序沒有（yǒu）不同（tóng），促卵（luǎn）泡（pào）素V的單次皮下注射與牛的（de）體況和性情有（yǒu）關（guān），更易接受超排處理的牛將會得到更優的效果。
一個可選用的穩定的單次FSH注射的超排反應應該（gāi）是將促卵泡素V和可生物（wù）降結合解的高分子（zǐ）聚合物相結合，來維持在幾天內穩定慢速的釋放激素（sù）。有好幾種生物或合成的不同材料性質的聚合物可用於維持藥物的緩慢釋放，這些物質是可降解的（de），對生物體組織（zhī）沒有免疫反應，適合於在動物體內使用，其中一種就是以透明質（zhì）酸為基礎的物質（SRF），在以前的研究中，就將促卵（luǎn）泡素V用SRF稀釋後單（dān）次注射進動（dòng）物體，可誘發超排反應（yīng）。一係列的實驗設計-評估使用SRF稀釋（shì）的促（cù）卵泡素V單次IM後，肉奶牛（niú）的超排反應，主要目的是確定使用SRF稀釋後的促卵泡素V單次注射的位點，對超排反應的穩定（dìng）性（xìng）（試驗1）；比較兩種不同濃度的SRF的IM注射結果（實驗2）；在安格斯奶牛上，比較注射SRF稀釋後促卵（luǎn）泡（pào）素V和注（zhù）射（shè）每日兩次的生理鹽水，證實前者誘發超排反應的能力。
2. 材料與方法
實驗1是用SRF稀釋後的促卵泡激素V注射（shè）不同位點的比（bǐ）較，雜種肉用奶牛（n=18）被隨機的分成3組（zǔ），在第0天（開始處理天（tiān）），所有的奶牛注射5mg 17β-雌二醇和50mg孕激素，並植入含1.56g 孕激素的陰道栓，在第4天，按以下處（chù）理進行奶牛的超排處理（lǐ）：第一（yī）組（對照組）：用生理鹽水稀釋400mg的 NIH-FSH-P1，每天2次頸部（bù）IM注射逐（zhú）漸遞減注射4天（80，80,60,60,40,40,20,20）；第二組：用（yòng）10ml的SRF（20mg/ml 透明質酸）稀釋400mg的 NIH-FSH-P1頸部IM注射； 第三組：在用10ml的SRF稀釋400mg的 NIH-FSH-P1耳部（bù）皮下（SC）注射。對於單次注射，是先將促卵泡素V用1ml的生理鹽水稀釋，然後注射進含有9ml、濃度為22mg/ml 的透明質（zhì）酸的小瓶中，輕微搖勻，並吸進（jìn）12ml的注射器中進行注射。在第6天（tiān）的早上和下午（FSH開始處理（lǐ）後的48小時），所有牛注射150mg PGF，並在下午撤栓。在第8天（tiān）的早上注射12.5mg的LH，並在12和24小時後（hòu）進行輸精。如果奶牛在第7天下午穩定接受爬（pá）跨（kuà），12小時後進行LH的注射（shè）和輸精，在第15天非手術法收集胚胎，並按照IETS的方（fāng）法評估質（zhì）量，IETS評估質量為1和2級的胚胎則認為是可移植（zhí）的胚胎。
實驗2是比較2種不同SRF濃度（dù）通過單次IM注射促卵（luǎn）泡素V後超排反應，實驗分（fèn）2階段進行處理，第一階段，15頭紅色（sè）安格斯奶牛按交叉設計進行兩次超排（pái）處（chù）理，第二階段，10頭紅色安格斯奶牛隨（suí）機分成（chéng）兩組，進行一次超排處理，在第4天時，按照實驗1的單次處理程（chéng）序（xù）用400mg的NIH-FSH-P1進行頸部IM注射，單次注射的試劑（jì）是將促卵泡素N的凍幹粉末用1ml的（de）生理鹽水稀釋，然後在（zài）12ml的注射器中與9ml的SRF（22mg/ml 透明質酸，100%溶液）或（huò）者50%的SRF稀釋（11mg/ml 透（tòu）明質酸（suān），50%溶液）在處理（lǐ）前混勻。輸精、胚胎采集和評估均按照（zhào）實驗1的進行處理。
實驗3是證實前麵（miàn）的結果，並比較用100%的SRF稀釋的促卵泡素V的單次IM注射和（hé）傳統的生理鹽水稀釋的促卵泡素V的每日2次的IM注射對紅色安格斯供體奶牛的超排影響，實驗（yàn）分兩個階段：第1階段，17頭紅色安格斯奶牛按交叉設計進行兩次超排處理，第二階段，24頭紅色安格斯（sī）奶（nǎi）牛隨機分成兩組，進行一次超排處理，在第4天（tiān）時，按照實驗1的用400mg的NIH-FSH-P1按（àn）每日兩次為期4天的遞減或按單次進行（háng）頸部IM注射，單次注射的試劑是將（jiāng）促（cù）卵泡（pào）素N的凍幹粉末用1ml的生理鹽水稀釋，然後在12ml的注射器中與9ml的（de）SRF（22mg/ml 透明質酸，100%溶液）在（zài）處理前混勻（yún），同實驗2。輸精、胚胎采（cǎi）集和評估均（jun1）按照實驗1的進行處理。
2.1 超聲波（bō）
所有的（de）奶牛在第（dì）0香蕉视频在线看第4天檢查黃體的存在，卵泡的大小和數量，奶牛的卵巢在超排處理期（qī）間（4-8天），每天都進行卵泡生長特性的超聲波檢測，在11天檢測排卵數量，在15天通過直腸檢查黃體數量來證實超排反應。
2.2 統（tǒng）計分析
實驗1中（zhōng）的數（shù）據（連續的狀（zhuàng）態分布和變異）按ANOVA進行評估，平均數通過LSD測試進行比較，實驗2和3的數據通過平方根（gēn）被初（chū）步轉化，然後使用Infostat進行ANOVA分析，通過保護LSD測試進行平（píng）均數的比較，ANOVA混合模式檢測天數、處理和（hé）天數與處理互作對≥9mm卵泡直徑和數量的影響（xiǎng），處理組間平均卵泡直徑的統計比較、每頭（tóu）牛的平均（jun1）卵泡直徑在卵巢上出現大於3mm的卵泡時開始進行測試。
3. 結果
實驗1的結果（guǒ）如表（biǎo）1所（suǒ）示，總胚胎數、受精卵和可移植胚胎數，用400mg FSH按每日2次為期4天的IM注（zhù）射比按400mg FSH單（dān）次耳部SC注射效果顯著好（P＜0.05）。而用單次IM注射後獲得的（de）總胚胎數、受（shòu）精卵（luǎn）和可（kě）移植胚胎數處於中間水平，與其它處理組間（jiān）沒顯著差異。圖1表（biǎo）示了在超排處理期間直徑≥9mm的平均卵泡數。在所有的處（chù）理組中，直徑≥9mm的平均卵泡數在第5-8天時增加（jiā）（即在第一次（cì）FSH處理後（hòu）的24小時），此後則減（jiǎn）少（天的影響，P＜0.001），此外，在6-8天，用每日（rì）2次IM注射促卵泡素V的（de）方法，將有（yǒu）更多的（de）≥9mm的卵泡生成。
在試驗2，在（zài）第1和2階段之間，沒有差異，所以（yǐ）將數據結合在一起（qǐ）。盡管CL的平（píng）均數沒（méi）有顯著（zhe）的差異，但總（zǒng）的卵子/胚胎數（P＜0.05）、受精卵（P＜0.01）和可移植胚胎數（P＜0.001）用100% SRF溶（róng）液（yè）的比50% 的要好的多（表2）。在胚胎采（cǎi）集時，50%SRF組中的2頭牛和100%中的1頭牛，其黃體數小於2；此外，50%SRF組中（zhōng）20頭（tóu）牛裏的8頭奶牛（40%）沒有產生任（rèn）何（hé）可（kě）移植的胚胎，而100%組中（zhōng）的所有奶牛都產生了至少（shǎo）一枚可移植胚胎。
在（zài）處理（lǐ）期間卵泡的（de）特性沒有什麽（me）不同，在注射促卵泡素V的當天直徑在3-5mm的卵泡數（第4天； 18.6±1.5 VS 16.4±1.6），排卵（luǎn）數（13.2±1.1 VS 10.4±1.4），LH處理（lǐ）後的平均排卵時間（30.8±1.3h VS 30.1±2.6h）在100%SRF 稀釋組和50%稀釋組組間沒有顯著差異，然而，所（suǒ）有（yǒu）直徑＞3mm（P=0.0662；圖2）和≥9mm（P=0.08994；圖3）的卵泡在處理期間都（dōu）傾向有時間和處理之間的互作作（zuò）用，使得在第7香蕉视频在线看第8天，用100% SRF 稀（xī）釋的促卵泡素組比50%的組有更大的平均卵泡直（zhí）徑（jìng）值（圖2）和≥9mm的卵泡數（圖（tú）3）。
在試驗3中，在第1和2階段（duàn）之間，沒（méi）有差異，所以將數據結合在一起。CL的數量、總胚胎數、受（shòu）精卵數和可移（yí）植胚胎數（shù）在組間沒有差異（P＞0.05；表（biǎo）3）。在胚（pēi）胎采集時，每組各有1頭牛其黃體數≤2，對照組中有1頭和單次注射組中有2頭（tóu）奶牛（niú）沒產生任何可移植胚胎。
在（zài）處理期間組間卵泡特性沒有什麽差異，所有直徑≥3mm（圖2）的（de）卵泡的平均（jun1）直徑，直徑在3-5mm、6-8mm和≥9mm的卵泡（pào）數都受到天數的影響（P＜0.001），但是（shì）組間沒有顯著的差異，也沒有互作（zuò）影（yǐng）響。此外，在注射促卵（luǎn）泡素V的（de）當天直徑在3-5mm的卵泡數（shù）（第4天；19.6 ± 1.5 VS 17.6 ± 1.3)，排卵數 (15.8±1.3 VS 14.5 ±1.7) LH處理後的平均排卵時間 (31.3± 2.3 h VS 35.1 ± 2.3 h)，在對照組（zǔ）和單次注射組之間沒有顯著差異。
4 討（tǎo）論
總的結果顯示，用20mg/ml的透明質（zhì）酸（100%的SRF溶液）稀釋促卵泡素V，並進行單次IM注射後，對（duì）紅安格（gé）斯供體牛有更好的超排效果，在產生的胚胎總數和可移植胚胎（tāi）數上，與傳統的（de）每日2次的IM注射的效果沒有顯著差異（yì）。值得注意（yì）的是在實驗2和3中，49頭（tóu）牛用100% SRF稀釋促卵泡素V後進行單次（cì）注（zhù）射後，僅有4頭（8%）沒產生（shēng）任何可移植胚胎，這比以前報（bào）道的（de）相關肉牛（24%）和荷斯坦奶牛的每日兩次（cì）IM注射的數值要小。實際上，在實驗（yàn）3中，每日兩次（cì）IM注射（shè）的29頭超排牛對照組中，僅有3頭（10%）沒有產生可移植胚（pēi）胎，顯然（rán）和單次IM注射的超（chāo）排反應組之間沒有（yǒu）差異。
注射後血液中的FSH濃度，由於處理吸收位點和代謝清除的不同而異，按照（zhào）代謝率，預測（cè）FSH以相同的（de）速率被（bèi）清除，而無論處理（lǐ）的方法和濃度（dù）如何。垂體提取物的快速吸收將導致其清除的（de）速率加快，因（yīn）此，卵泡在較（jiào）大（dà）濃度的（de）FSH的生長時間減少，不能維持（chí）在排卵前。以前的文獻結（jié）果顯示，促卵泡素V生理鹽（yán）水稀釋、並在（zài）單次IM或SC注射後（hòu）（瘦肉型動物），血液中FSH達到相似的高濃度（dù），並（bìng）比體況較好（hǎo）接受了（le）單次SC注（zhù）射的奶牛體內的FSH下降更快，推（tuī）測是由於體況好的奶牛吸收較慢的原因。將FSH用聚乙烯（xī）比（bǐ）咯烷酮稀釋，比對照的生理鹽（yán）水（shuǐ）稀釋將（jiāng）導致其吸收（shōu）更慢、時間更長、血液中FSH濃度更高。我們推斷將促卵泡素V和透明（míng）質酸混合也將減緩吸收速（sù）度，維（wéi）持血液（yè）中FSH的較高水平，因此，在單次（cì）注射促卵泡素V誘發超排（pái）反應中，FSH的吸收（shōu）速率是影響因素，而不（bú）是清楚的速率。
試驗1的結果顯（xiǎn）示，將促卵泡素V和透明質酸（suān）混（hún）合（hé）單次SC耳部注射，沒有產生較好的（de）效果，但單次的IM注射和（hé）目前已（yǐ）接受的每日2次（cì）的生理鹽（yán）水稀釋的處理效果沒有顯著的（de）差異（yì）（盡管在數值上小一點），然而，將促卵泡素V和透（tòu）明質酸混合的方法將值得參考，20mg/ml的透（tòu）明質酸（suān）（100% SRF）溶液是非常粘稠的，其混合促卵泡素V後是可以觀察的到（dào）的，所以不可能（néng）從小瓶中完全的抽吸出來，因此（cǐ）推斷（duàn）單次IM注射後較低的超排反應可能是由於FSH比原計劃的劑量小的緣故，此推論從卵泡的生殖特性上可（kě）證（zhèng）實，盡管在（zài）激素處理開始時，起（qǐ）初的卵泡（3-5mm）數量沒有差異，而達到9mm或更大直（zhí）徑的在單（dān）次注射組是較少的（de）（圖1），故比促卵泡素V和20mg/ml的透明（míng）質酸混合的方法外（wài），還需探索一種更易吸取的（de）方法，這也是我們在實（shí）驗其中使用較低濃度（10mg/ml透明質酸；50% SRF）的透（tòu）明質酸的原因，50% SRF溶液不是十分粘稠故更容易從小（xiǎo）瓶中吸取。
在實驗2和3中，在注（zhù）射器內混合（hé）生理鹽水中的（de）促卵泡素V和SRF溶（róng）液，對超排反應更加有效。然而，50%的（de）SRF溶液比100%的超排效果不佳，在實驗2中，卵泡的直徑特性顯示用（yòng）50%的SRF溶解促（cù）卵泡素V可（kě）誘發超（chāo）排反應，但卵泡（pào）的生長似乎在延遲2天後（第（dì）6天；圖2），比100% SRF組（圖3）出現了較少（shǎo）的能達到排卵大小的卵泡（pào），推測是由於（yú）在後半部分處理時，FSH不足的原因，正如（rú）以前在荷（hé）斯坦（tǎn）奶牛上用生理鹽水稀釋（shì）的促（cù）卵泡素V皮下處理的效果（guǒ）一（yī）樣。
在實驗3中，與傳統的（de）每日2次共4天的IM注射程序相比較，應用20mg/ml的透明質酸（100% SRF）稀釋促卵泡激素V後單次IM注射的效（xiào）果也非常有效。在各測試的項目上，兩組間沒有顯著的差異（yì），與以前文獻中報道的每日2次（cì）處理程序後的（de）可移（yí）植胚胎數相比，其數量很（hěn）高。值得注意的是在處理初期，對FSH易（yì）反（fǎn）應的卵泡（直徑為3-5mm）數量在兩組間沒有差異，事實上（shàng），對照（zhào）組的數（shù）量還占優。另外，兩組間的排卵數和LH處理後到排卵（luǎn）的時間間隔上都沒有差異，兩組間無差異的卵（luǎn）泡生長特性顯示了單次IM注射促卵泡素V可為卵（luǎn）泡的（de）生長至排卵階段提供充足的FSH。
實驗3是一個用（yòng）透明質酸稀釋促卵泡激素V後單次注射誘發奶牛（niú）超排反應的相當嚴謹的測（cè）試，相比於傳統的每日（rì）2次的IM注射模式（shì），此測試不（bú）僅證實（shí）卵泡生長特性，而且在測試（shì）的各變量間，包括排卵率、胚胎產量和更主要的可移植胚胎數都沒有差異，盡管單次IM注射處理中的最佳促卵泡素V的劑量沒有被測試，但這與每日2次注射的劑量相似，也和以前報道的單次促卵泡素SC注射的（de）劑量相近。
5. 結論
總的概括，相比（bǐ）於傳統的每日2次（cì）的IM注（zhù）射處理程序，用20mg/ml的透明質酸稀釋的促卵（luǎn）泡素V單次注射後的紅安格斯供體奶牛的超排反（fǎn）應也是（shì）較好的，對於混合促卵泡素和透明質酸的方法（fǎ）將是可行的，但對於安格斯牛所使用的這（zhè）一劑量是否最優還不太清楚，促卵泡素V的單（dān）次肌肉內注射將減少超排處理中的勞動強度和處理（lǐ）程序，特別是對於難以進行超排處理操作的動（dòng）物而言，此方法將更加適用。 |
